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                    斑
 
、基本原理
    具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温度及离子强度等)可按碱基互补原则形成双链,此杂交过程是高度特异的。杂交的双方是待测核酸及探针。
二、器材
    杂交炉,PCR 仪,Bio-Rad 紫外分光光度仪,镊子等。
三、试剂
1.尼龙膜,带阳性电荷,Roche公司产品。
2.  Herring sperm DNA
3. 甲酰胺
4. Denhardt
5. Blocking reagent
6.  Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments (from sheep): Roche公司产品NBT/BCIP
7.Buffer 150mM Tris-HCl(pH7.5)150mM NaCl
8. Buffer 290%Buffer 110% 封闭液。
9. Buffer 3100mM Tris-HCl(pH9.5)100mM NaCl50 mM MgCl
10. 显色液:25ml NBT(100mg/ml)19ml BCIP(50mg/ml),加5ml Buffer 3
11. 终止液:10mM Tris-HCl(pH8.0)1mM EDTA
12.杂交buffer: 50%甲酰胺、5×SSC5×Denhardt溶液、25mg/ml经变性并断裂成片段的鲑精DNAThe hybridization buffer can be stored frozen at -20.
13. 10% SDS (w/v)
14. 20×SSC: 3M NaCI, 0.3 M Na-citrate, pH7.0 (20)
15. 2×SSC; 0.1% SDS (w/v), sterile.
16. 0.1×SSC; 0.1% SDS (w/v), sterile.
17. Buffer 4: 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH8.0 (20)
四、操作步骤
1.膜预处理:将膜分为若干个点样区域,两个点样区域间相距0.5cm,每个点约  3mm直径(光滑平整的吸管的直径大小)。先将膜在水中浸湿,然后浸在20×SSC中,约15min。取出膜,将膜上的溶液滴尽后平放于两层滤纸中间,于室温晾干10min,直至膜微干,不滴水。同时将probe置于沸水浴中10min,冰上骤冷
2.点样:带正电荷的尼龙膜,每个探针点样约2μl,在80℃烘烤2h
3.预杂交: 42℃,2h.
将膜放置于封口袋或者盒子中,按每平方厘米尼龙膜0.2ml的量加入预杂交液。将杂交袋放入预先加热到42℃的杂交炉或者水浴中。预杂交液:50%甲酰胺、5×SSC2×Denhardt溶液、25mg/ml经变性并断裂成片段的鲑精DNA。轻轻摇晃。预杂交与杂交之间不要使膜干燥。
4.杂交:
①. PCR扩增产物纯化后然后定量,煮沸5分钟,置冰浴(热变性)。
②.弃预杂交液,换新的杂交液,加入探针,使其浓度在40100ng/ml, 混匀,继续于42℃杂交16h
5.100 ml buffer 1洗膜15min,洗2次,洗去未结合的抗体。
6.加抗体:用Buffer1 稀释anti-Dig-AP反应液(13000-5000),反应1hr。弃液后,用buffer 1洗膜15min,洗2次。
720ml buffer 3平衡5min
8.显色:加入显色液5ml,显色,避光反应30min-1hr或过夜。显色过程中不要振荡混匀。
950ml buffer 4洗膜5min,终止反应。
杂交膜可以保存在封有buffer 4的袋子中。
 

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