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      免疫组织化学方法               

一、Envision 二步法
1、切片脱蜡至水
2、阻断内源性过氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30% H2O2)室
   温20分钟。 水洗
3、pH7.2缓冲液洗三次。(如后面用高温处理,用蒸馏水洗)
4、胰蛋白酶消化37 ℃,30分钟。(或按说明书要求:放入(Ph6.0的柠檬酸缓冲液)抗原修复液内微波修复20分钟、或电炉加热30分钟、或高压锅加帽出气后3分钟,流水冲洗,快速冷却;)。或不处理
5、蒸馏水洗,pH7.2缓冲液洗三次。
6、滴加正常血清37 ℃,5-20分钟。
7、擦去多余血清,加一抗,37 ℃,60分钟。
8、pH7.2缓冲液洗三次。
9、滴加Envision二抗,37 ℃,60分钟。
10、pH7.2缓冲液洗三次。
11、DAB显色3~10分钟。
12、水洗。
13、苏木素淡染2-3分钟,蓝化,脱水,透明,封固。
二、ABC 法(SP法相步骤相同)
1、切片脱蜡至水
2、阻断内源性过氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30% H2O2)室
   温20分钟。
3、pH7.2缓冲液洗三次。(如后面用高温处理,用蒸馏水洗)
4、胰蛋白酶消化37 ℃,30分钟。(或按说明书要求:放入抗原修复液内微波修复20分钟、或电炉加热30分钟、或高压锅加帽出气后3分钟,快速冷却;或不处理)
6、滴加正常血清37 ℃,30分钟。
7、擦去多余血清,加一抗37 ℃,5-20分钟。,
8、Ph7.2缓冲液洗三次。
9、滴加二抗,37 ℃,30分钟。
10、Ph7.2缓冲液洗三次。
11、滴加ABC复合物,37 ℃,45分钟。
12、Ph7.2缓冲液洗三次。
13、DAB显色3~10分钟。
14、水洗。
15、苏木素淡染,蓝化,脱水,透明,封固。
三、免疫荧光
1、    冰冻切片6~8微米
2、    放入TBS内轻洗1 分钟
3、    滴加荧光抗体(37 ℃,60分钟)
4、    蒸馏水轻洗1分钟,(三道)
5、    甘油封固。
四、常用免疫组化试剂配制
 
1、DAB:   3 mg DAB  +  5ml  PBS(Ph7.6)
           用前加30% H2O2 5μl
2、胰酶:  100mg 氯化钙  +  蒸馏水100 ml → 0.1% 氯化钙
           50 mg胰酶  +  0.1%氯化钙 100 ml
           用1N NaOH调Ph至7.8
3、TBS:   缓血酸胺  91.5g
           NaCl      127.5g
           HCl       55.5ml          加水至15000 ml(Ph7.2)
4、PH 9.0 TrisEDTA抗原修复液(1Mm EDTA,50Mm Tris)
      AEDTA        2.922g
      BTris        60.55g
将A、B两种溶质加蒸馏水10000ml溶解,再用NaOH或Hcl调至PH9。
5、抗原修复液:0.01M 枸橼酸缓冲液 (Ph6.0 ± 0.1):
          A10.5 g  枸橼酸 (1H20)          加水至500 ml
          B: 44.1g  枸橼酸钠 (2H20)         加水至1500 ml
          取A液315毫升和B液1435毫升加17500毫升蒸馏水
6、APES :
   临用前用丙酮 1:400 稀释,将玻片浸入其中60秒,拿出,在无尘环境下干燥,备用。
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