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SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质
一、目的要求
1.
学习电泳原理和技术
2.
学习和掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术
 
二、原理
      
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide,简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(NNmethylene-bisacylamide,简称Bis)在加速剂NNNN—四甲基乙二胺(NNNN ethylenedia mine,简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8,简称AP)或核黄素(ribofavinvita min B2C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶,以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE)
聚丙烯酰胺凝胶有下列特性:
(1)
在一定浓度时,凝胶透明,有弹性,机械性能好;
(2)
化学性能稳定,与被分离物不起化学反应,在很多溶剂中不溶;
(3)
pH和温度变化较稳定;
(4)
几乎无吸附和电渗作用,只要Acr纯度高,操作条件一致,则样品分离重复性好;
(5)
样品不易扩散,且用量少,其灵敏度可达10-6g
(6)
凝胶孔径可调节,根据被分离物的分子量选择合适的浓度,通过改变单体及交联剂的浓度调节
       凝胶的孔径;
(7)
分辨率高,尤其在不连续凝胶电泳中,集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄
       电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。
 
       凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。
                       表1  分子量范围与凝胶浓度的关系 
                               
分子量范围
适用的凝胶浓度/(%)
蛋白质
104
1-4×104
1-5×104-1×105
1×105
5×105
20-30
15-20
10-15
5-10
2-5
核酸(RNA)
104
104-105
105-2×106
15-20
5-10
2-2.6
         聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。目前常用的多为圆盘电泳和板状电泳,两者电泳原理完全相同
         不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液为pH6.7Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶,凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性,这是样品浓缩的主要因素。
     电泳(SDS-PAGE:蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时,它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS),则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量,而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。

三、试剂与器材
试剂:10%SDS凝胶贮液(30ACr-0.8%Bis)、分离胶缓冲液(3.0 mol/L pH8.9TrisHCl       缓冲液)、浓缩胶缓冲液( 0.5 mol/L pH6.7TrisHCl 缓冲液)、10%过硫酸铵、
          10%  TEMEDpH8.3Tris-Gly电极缓冲液、1%琼脂糖溶液、0.05%考马斯亮兰R250     
          7%醋酸
器材:垂直板电泳槽、稳压稳流电泳 、脱色摇床
 
四、操作方法
1.
安装夹心式垂直板电泳     
(1)
装上贮槽和固定螺丝销钉,仰放在桌面上。
(2)
将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中,注意勿用手接触灌胶面的玻璃。
(3)
将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上,短玻璃板应面对上贮槽。
(4)
将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽,双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。
(5)
竖直电泳槽,在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂()。其目的是封住
   空隙,凝固后的琼脂()中应避免有气泡。
2
.配胶
                          表2  SDS–不连续体系凝胶的制备
试剂名称
配制20mL不同浓度的分离胶所需试剂用量/mL
配制10mL浓缩胶所需试剂用量/mL
浓度
7.5%
10%
15%
3%
凝胶贮液
分离胶缓冲液
(pH8.9 Tris-Hcl)
浓缩胶缓冲液
(pH6.7 Tris-Hcl)
10% TEMED
10% SDS
重蒸水
5.00
 
2.50
 
——
0.10
0.20
12.10
6.66
 
2.50
 
——
0.10
0.20
10.44
10
 
2.50
 
——
0.10
0.20
7.10
1.00
 
——
 
1.25
0.05
0.10
7.55
混匀后,置真空干燥器中,抽气10min
10%过硫酸铵
0.10
0.05
3. 制备凝胶板
      
将混合后的分离胶溶液,用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内,加胶高度距样品模板梳齿下缘约1 cm。用1 mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水(34 mm),用于隔绝空气,使胶面平整。30-60 min凝胶完全聚合,则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。
      
将上、下贮槽的蒸馏水倒去,将混合均匀后的浓缩胶溶液,用细长头的滴管加到长、短玻璃板的窄缝内(即分离胶上方),距短玻璃上缘0.5 cm处,轻轻加入样品槽模板.在上、下贮槽中加入蒸馏水,但不能超过短玻璃板上缘。静置电泳槽,10 min左右,上胶即可聚合,再放置10-20 min,加入电极缓冲液,使液面没过短玻璃板约0.5 cm,轻轻取出样品槽模板,即可加样。 
4.
样品的处理及加样
      
将样品按0.51 mg/mL加样品溶解液,溶解后,将其转移到带塞的小离心管中,轻轻盖上盖子(不要塞紧,以免加热时迸出),在100℃沸水浴中加热3min,取出冷却后加样。
  
   用微量进样器取25 l上述混合液,通过缓冲液,小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。
5 .电泳
  
   将电泳仪的正极与下槽连接,负极与上槽连接,接通冷却水,打开电泳仪开关,开始时电流为10 mA,待样品进入分离胶后,将电流调至20-30 mA,当溴酚蓝染料距硅胶框1 cm时,停止电泳,关闭电源及冷却水。
6 .
染色与脱色
     电泳
结束后,取下凝胶模,卸下硅胶框,用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板,从凝胶板上切下一角作为加样标记,在两侧溴酚蓝染料区带中心,插入细铜丝作为前沿标记。加入染色液染色1-2 h,再用脱色液脱色,直至蛋白质区带清晰,即可计算相对迁移率。
7.
结果处理
  
   量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm),按下式计算相对迁移率mR:
 
                                              蛋白质样品加样端迁移距离(cm
            相对迁移率MR=_________________________
                                             
                                               溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm

五、注意事项
1)安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝,避免缓冲液渗漏。
2)用琼脂()封底及灌胶时不能有气泡,以免电泳时影响电流的通过。
3)样品中应含一定浓度的蔗糖溶液,目的是用以防止样品因对流而被稀释。
4)加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡,如有气泡,可用注射器针头挑除。
 
 
                               
 
 
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