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基因诱导表达及鉴定
实验目的:鉴定表达的重组蛋白
实验试剂:
1IPTG 1mol/L0.5ml3管)
2SDS-PAGE试剂
a0.1mol/L磷酸钠缓冲液(PBS):1mol/L Na2HpO4 68.4ml   1mol/L NaH2PO4   
      31.6ml
b2×loading buffer :0.1M Tris-HCl pH6.8,4%SDS,20%Glycerol,0.2M DTT,0.2%
   Bromophenol Blue。
CTris-甘氨酸缓冲液:25mmol/L Tris, 250mmol/L甘氨酸,0.1%SDS。
d、聚丙烯酰胺(Acrylamide;,N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(Bisacrylamide);十二烷基硫酸
   钠;N,N,N',N'-四甲基乙烯酰胺(TEMED;过硫酸胺考马斯亮蓝R250
3Western Blot试剂
a、转移缓冲液: 39mmol/L甘氨酸,48mmol/L Tris碱,0.037% SDS(电泳级),20%
醇。    
b二抗封闭液:5%(W/V)脱脂奶粉,150mmol/L NaCl,50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)
C封闭液:5%(W/V)脱脂奶粉,0.02%叠氮钠,溶于磷酸缓冲盐溶液。
d、一抗:兔抗Hp血清;二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG,武汉博士德生物工程公司产品,配套显色液DAB。
e无磷酸盐洗涤液:150mmol/L NaCl,50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)
 
实验步骤:
一、诱导表达:
1.重组质粒转化:重组质粒各1ml,加入到100ml感受态大肠杆菌中,设空质粒为阳性对照和感受态大肠杆菌为阴性对照。37℃,培养16h
2.细菌扩增:用无菌接种环从平板上挑取5个克隆,分别接种到3ml50mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中,并设阴性对照,300r/min振摇过夜。
3.诱导表达:次日,吸出60μl菌液接种到3ml含50mg/ml氨苄青霉素LB液体培养基中37℃,300r/min振摇至OD值=0.4。每管菌液各取出1ml加入IPTG至终浓度为1mmol/L,另吸出1ml不加IPTG作对照。37℃,300r/min,培养4h。4℃,12000r/min离心1min,弃上清。每管加1ml PBS,混匀,同法离心。弃上清,每管加入50ml PBS、50ml 4 ×loading buffer,重悬沉淀,100℃煮沸5min,置-20℃备用。
 
二、SDS-PAGE测定融合蛋白分子量
1.洗净玻璃板,按说明书安装电泳装置。
2.配胶:8%分离胶组分为:ddH2O 2.3ml,30% Acrylamide 1.3ml,1.5mol/L Tris (pH 8.8)1.3ml,10%SDS 0.05ml,10%过硫酸氨 0.05ml,TEMED 0.004ml。混合后,注入已安装玻璃板的间隙中,上覆纯水隔离空气。5%积层胶5ml组份为:ddH2O 3.4ml,30% Acrylamide 0.83ml,1.0mol/L Tris (pH6.8) 0.63ml,10%SDS 0.05ml,10%APS 0.05ml,TEMED 0.005ml。混合后,加入已凝聚的分离胶上,插入电泳梳子。
3.凝胶电泳:分别将各样品10ml加入凝胶梳孔中,留取一孔加入蛋白Marker10ml,空孔加
10 ml 1×loading buffer置于垂直电泳槽内,向上下槽分别加入电泳缓冲液,56V稳压电泳
至溴酚蓝指示剂泳动至积层胶与分离胶结合处(约20min左右),调整电压至105V,电泳至指
示剂泳动至分离胶下端边缘(约50min左右)停止电泳。
4.染色:将5倍体积染色液考马斯亮蓝R250加入染色缸中,摇床轻摇1h,至凝胶全部着色。
5.脱色:反复更换脱色液至本底透明,成像仪摄片。
 
三、Western blot 鉴定融合蛋白的免疫反应性
1.戴上手套,取下电泳好的凝胶转移到一盘去离子水中略为漂洗一下,立即放在3张转膜缓冲液
   浸湿的Whatman 3MM滤纸上,盖上1张经去离子水浸泡的硝酸纤维素滤膜,排除气泡后,盖上另
   3张同样处理的滤纸,排除气泡。用刀片切除多余的滤纸和滤膜,使其大小均与凝胶完全吻
   合,用塑料夹夹紧后放入转移电泳装置。
2.加满新鲜配制的转膜缓冲液,转好电极位置,使凝胶位于负极,硝酸纤维素滤膜位于正极。
   400mA恒流电泳75min。
3.封闭:电泳结束后,取下硝酸纤维素滤膜用PBS淋洗后,放入封闭液中,置4℃摇床轻摇1h。
4.一抗反应:取出滤膜放入含1: 1000浓度的第一抗体的封闭液, 置4℃摇床轻摇2h。
5.洗涤:废弃封闭液和抗体,用250ml PBS漂洗滤膜3次,每次10min;再用无磷酸盐洗涤液洗涤
   1次10min。
6.二抗反应:硝酸纤维素滤膜放入含1:700浓度的第二抗体封闭液中,置4℃摇床轻摇1h。
7.洗涤:无磷酸盐洗涤液洗涤3次,每次10min。
8.显色:显色液临用时配制,取250ml DAB加入10ml无磷酸盐洗涤液、10ml30%H2O2混匀;洗净后
   的硝酸纤维素滤膜放入显色液中反应3min,用水终止反应,成像仪摄片。
 
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